C18色譜柱出峰順序解析！
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在反相色譜(RP-HPLC)中，C18 色譜柱的出峰順序主要由化合物的極性決定，遵循 “極性強(qiáng)的物質(zhì)先出峰，極性弱的物質(zhì)后出峰” 的規(guī)律。以下是具體影響因素和常見應(yīng)用場景的詳細(xì)解析：
一、核心原理：疏水性相互作用主導(dǎo)保留
C18 色譜柱的固定相表面鍵合了長鏈烷基(C18)，具有強(qiáng)疏水性。流動(dòng)相通常為極性溶劑(如水、甲醇、乙腈)，因此：
極性強(qiáng)的化合物(如含羥基、羧基、氨基的物質(zhì))與固定相作用弱，在流動(dòng)相中溶解度高，保留時(shí)間短，先出峰;
極性弱的化合物(如芳烴、脂溶性物質(zhì))與固定相疏水性作用強(qiáng)，保留時(shí)間長，后出峰。
二、影響出峰順序的關(guān)鍵因素
1.?化合物極性與官能團(tuán)
極性基團(tuán)數(shù)量：
例：甲醇(極性強(qiáng)，含 1 個(gè)羥基)<乙醇(極性稍弱，含 1 個(gè)羥基，但碳鏈更長)<丙三醇(極性強(qiáng)，含 3 個(gè)羥基)。
規(guī)律：極性基團(tuán)(如 – OH、-COOH、-NH?)越多，親水性越強(qiáng)，出峰越早。
疏水基團(tuán)(碳鏈 / 環(huán)結(jié)構(gòu))：
例：苯(非極性，疏水性強(qiáng))>甲苯(甲基取代，疏水性略強(qiáng)于苯)>苯酚(羥基取代，極性增強(qiáng))。
規(guī)律：碳鏈越長、環(huán)狀結(jié)構(gòu)(如苯環(huán))越多，疏水性越強(qiáng)，出峰越晚。
2.?流動(dòng)相組成(有機(jī)相比例)
有機(jī)相(甲醇 / 乙腈)比例升高：流動(dòng)相極性降低，化合物在流動(dòng)相中溶解度增加，與固定相作用減弱，保留時(shí)間縮短。
例：用 50% 乙腈水溶液時(shí)，某芳烴保留時(shí)間為 10 min;若乙腈比例增至 70%，保留時(shí)間可能縮短至 5 min。
3.?pH 值(對(duì)解離型化合物的影響)
弱酸 / 弱堿類物質(zhì)(如羧酸、胺類)的極性受 pH 影響：
酸性化合物(如苯甲酸)：
在低 pH(＜pKa）下，以分子形式存在，極性弱，保留時(shí)間長；
在高 pH(>pKa)下，解離為羧酸根(-COO?)，極性強(qiáng)，保留時(shí)間短。
堿性化合物(如苯胺)：
在低 pH 下，解離為銨根(-NH??)，極性強(qiáng)，保留時(shí)間短;
在高 pH 下，以分子形式存在，極性弱，保留時(shí)間長。
4.?空間結(jié)構(gòu)(立體異構(gòu))
同分異構(gòu)體：
例：鄰、間、對(duì)硝基苯酚的極性差異：
鄰位(形成分子內(nèi)氫鍵，極性降低)>間位(極性較高)>對(duì)位(極性最高)，因此在 C18 柱上的保留時(shí)間：鄰位>間位>對(duì)位。
三、常見化合物的出峰順序?qū)嵗?/span>
| 化合物類別 | 典型物質(zhì) | 極性排序 | C18 柱保留時(shí)間排序（從短到長） |
| 糖類 | 葡萄糖、果糖、蔗糖 | 高→低 | 葡萄糖≈果糖＜蔗糖（分子量更大） |
| 有機(jī)酸 | 乙酸、苯甲酸、硬脂酸 | 高→低 | 乙酸＜苯甲酸＜硬脂酸 |
| 胺類 | 乙胺、苯胺、N – 甲基苯胺 | 高→低 | 乙胺（強(qiáng)極性）＜N – 甲基苯胺＜苯胺 |
| 酚類 | 苯酚、甲苯酚、萘酚 | 高→低 | 苯酚＜甲苯酚＜萘酚（疏水性增強(qiáng)） |
| 藥物 | 阿司匹林（極性）、布洛芬（弱極性） | 高→低 | 阿司匹林＜布洛芬 |
| 脂溶性維生素 | 維生素 C（極性）、維生素 E（脂溶性） | 高→低 | 維生素 C＜維生素 E |
四、應(yīng)用場景與優(yōu)化策略
1.?藥物分析
目標(biāo)：分離極性差異大的藥物及其雜質(zhì)(如主藥與疏水性降解產(chǎn)物)。
策略：通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相 pH(如用磷酸鹽緩沖液)使藥物解離，縮短保留時(shí)間，同時(shí)讓雜質(zhì)保留在柱上。
2.?環(huán)境污染物檢測(cè)
目標(biāo)：分離多環(huán)芳烴(PAHs)、農(nóng)藥殘留(如有機(jī)氯)。
策略：使用高比例乙腈(如 90% 乙腈水)降低流動(dòng)相極性，增強(qiáng)疏水性物質(zhì)的保留，實(shí)現(xiàn)基線分離。
3.?食品添加劑分析
目標(biāo)：檢測(cè)防腐劑(如苯甲酸、山梨酸)。
關(guān)鍵點(diǎn)：在酸性條件(pH 2.5-3.0)下，苯甲酸以分子形式存在，與 C18 作用較強(qiáng)，需用梯度洗脫(如水→乙腈)使其出峰。
五、注意事項(xiàng)
1、避免強(qiáng)保留物質(zhì)污染
樣品需預(yù)處理(如過濾、固相萃取)，防止油脂、蛋白等不可逆吸附在 C18 柱上，導(dǎo)致柱效下降。
2、流動(dòng)相兼容性
避免使用純水長時(shí)間沖洗 C18 柱(可能導(dǎo)致固定相坍塌)，建議有機(jī)相比例不低于 5%。
3、柱效監(jiān)測(cè)
定期用甲苯(測(cè)試疏水性保留)和尿嘧啶(測(cè)試死體積)評(píng)估柱效，若峰展寬或拖尾嚴(yán)重，需再生或更換色譜柱。
?通過調(diào)控極性、流動(dòng)相組成和 pH 值，C18 色譜柱可靈活分離各類化合物。實(shí)際應(yīng)用中需結(jié)合目標(biāo)物性質(zhì)優(yōu)化方法，必要時(shí)通過質(zhì)譜(MS)或二極管陣列檢測(cè)器(DAD)輔助定性，確保分離效果與檢測(cè)準(zhǔn)確性。
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發(fā)布于: 2023-08-26